磁珠法基因组DNA小量提取试剂盒

产品货号：

YTB5788

中文名称：

磁珠法基因组DNA小量提取试剂盒

英文名称：

BalbMag Universal Genomic DNA Purification Mini Kit with Magnetic Beads

产品规格：

50T

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本制品是一种基于磁珠法的高效便捷的基因组DNA抽提试剂盒。本制品可以用于抽提动物组织、鼠尾、培养细胞、细菌、酵母、动物血液、昆虫以及固定组织的包括基因组DNA在内的总DNA，也可以用于长度大于100bp DNA片段的抽提。本试剂盒通过说明书中提供的不同操作方法，可以抽提除植物样品外的几乎所有样品中的总DNA。

本试剂盒纯化得到的基因组DNA的长度最长可达50kb左右，平均为30kb左右，最短为100bp的DNA也可以被纯化。如需获得更长的基因组DNA，对于哺乳动物样品，包括组织或细胞等，可以使用动物基因组DNA抽提试剂盒。

按照本试剂盒的标准操作步骤抽提得到的总DNA会含有少量的RNA，但如果按照可选步骤加入适量的DNase-free的RNase A，就可以获得不含RNA的高纯度总DNA。含有RNA的总DNA可以用于PCR，但对于某些其它的后续反应可能会产生一些影响。

本试剂盒中的BalbMag磁珠，每20μL磁珠悬液对于DNA的最大结合容量约为30μg。通常每200万HeLa细胞或500万淋巴细胞可以抽提得到15～25μg总DNA，每25mg肝、脑、肾组织可以抽提得到10～30μg总DNA，每25mg心、肺组织可以抽提得到5～10μg总DNA，每10mg脾组织可以抽提得到5～30μg总DNA，每1.2cm小鼠尾尖或0.3cm大鼠尾尖可以获得10～25μg总DNA。

组分	规格
BalbMag磁珠	1.1mL
样品裂解液A	10mL
样品裂解液B	11mL
洗涤液Ⅰ	21mL
洗涤液Ⅱ	16mL
洗脱液	22mL
蛋白酶K	1.1mL

保存：室温，有效期1年。

注意事项

BalbMag磁珠长期不使用时，可以4℃保存，4℃可以保存更长时间。蛋白酶K室温(15～25℃)存放一周，活力无明显下降。
洗涤液Ⅰ首次使用前加入7mL无水乙醇，洗涤液Ⅱ首次使用前加入24mL无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
需自备磁分离装置。
抽提细菌、酵母样品时还需要一些特定的试剂，详情请参考使用说明中的相关描述。
如需制备不含RNA的高纯度总DNA，需自备DNase free的RNase A，推荐订购RNase A(不含DNase)。
温度较低时样品裂解液A或样品裂解液B中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍。如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。
磁珠在静置后会发生沉降，使用前一定要适当涡旋震荡或颠倒数次至充分混匀。
磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。
请使用推荐的样品量。如果样品量过大，可能造成磁珠聚集，会影响洗涤进而影响抽提获得的DNA纯度。发生磁珠聚集时，洗涤时需尽量分散磁珠，这样可有效改善抽提效果。如果发生磁珠聚集现象，建议在后续实验中适当减少样品用量。
本试剂盒的某些步骤需使用55℃和70℃水浴，请提前作好准备。
除特别说明外，每次Vortex应控制在5～10秒左右。
本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。
参考如下使用说明，从某些样品中抽提总DNA不需要使用样品裂解液A。

本试剂盒的原理和操作流程如图1所示。样品首先被蛋白酶K消化，释放出来的基因组DNA在特定条件下与磁珠特异性结合。在外界磁场(如磁分离架)的作用下，磁珠与相应溶液可以快速高效地分离。随后通过两次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液将DNA从磁珠上洗脱下来。整个过程无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，样品裂解后仅需约15分钟即可完成。

图1.磁珠法基因组DNA小量提取试剂盒操作流程示意图。

使用效果

本试剂盒按照推荐的操作步骤，每次可抽提少至数百个细胞，多至25mg组织、0.5-1cm鼠尾、500万个培养细胞、20亿个细菌或5000万个酵母。样品用量过多，反而会影响抽提效果。如果待抽提样品的DNA含量小于5ng，建议加入适当量的carrier DNA，例如poly-dT或其它对后续实验没有干扰的DNA，也可以加入适当量的carrier RNA，例如酵母RNA等，以改善抽提效果。本试剂盒与柱式基因组DNA小量提取试剂盒的提取效果对比参见图2。如图2所示，本试剂盒用于提取细胞和组织样品的DNA时，提取得到的DNA的量与离心柱式试剂盒相当。

图2.磁珠法基因组DNA小量提取试剂盒和柱式基因组DNA小量提取试剂盒用于从HEK293T细胞和小鼠组织抽提基因组DNA的效果图。图A使用两款试剂盒分别抽提100万HEK293T细胞的总DNA，图B使用两款试剂盒分别抽提小鼠组织(肝脏、脑和肌肉)的总DNA，洗脱液用量均为50μL，取8μL洗脱后的样品混合1.6μL 6×DNA上样缓冲液(红色)，使用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

使用方法

从动物组织中提取总DNA：
- 取不超过25mg的组织(脾不超过10mg)，尽量在10mg左右，剪切成尽可能小的碎片，加入180μL样品裂解液A。或置于液氮中研磨成粉末，再加入180μL裂解液A。也可将组织置于1.5mL离心管中，加入180μL冰浴预冷的裂解液A，用微型电动匀浆器匀浆，或者用普通玻璃匀浆器进行匀浆。
  请勿使用过多的样品，过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效果提高。新鲜或冻存的组织均可，但固定过的组织请参考后续的其它步骤进行。
- 加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
  在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1～3小时内完成。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
- 清除RNA (可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4μL 100mg/mL RNase A，Vortex混匀。室温(15～25℃)放置2分钟。
  转录活性水平很高的组织例如肝和肾组织，RNA含量很高，在不做清除RNA的操作步骤(步骤1.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤1.d。
- 最高速剧烈Vortex 15秒。加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
  加入样品裂解液B后需立即Vortex混匀。加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，但大多数情况在70℃孵育后会溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不会干扰后续实验。有些组织例如肺、脾，在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物，此时需剧烈晃动或Vortex样品，以尽量破坏凝胶状物。
- 加入200μL无水乙醇，Vortex混匀。
  加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部用于和磁珠的结合，沉淀不会影响抽提效果。
- 向步骤e中的混合物加入20μL BalbMag磁珠悬液(使用前务必混匀)，轻柔混匀后，室温放置3～5分钟。将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸除残液。
  磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要，可适当增加磁珠用量，延长结合时间以提高得率。
- 加入500μL洗涤液Ⅰ，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
- 加入600μL洗涤液Ⅱ，轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
- 将离心管室温放置5～10分钟，或置于37℃鼓风烘箱5分钟，确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。
- 加入50～100μL洗脱液，轻柔震荡使磁珠悬于溶液中，室温孵育3～5分钟，其间甩动离心管1～2次。将离心管置于磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸取溶液至新离心管中，置于-20℃保存。所得溶液即为纯化的总DNA。
  如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20μL，但洗脱下来的DNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原磁珠再洗脱一次，可提高得率约10～30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15～40%的DNA。
从鼠尾中抽提总DNA：
- 取0.4-0.6cm的大鼠尾尖一段，或小鼠尾尖最多两段，加入180μL样品裂解液A。
  小鼠尾尖最长不能超过1.2cm，大鼠尾尖不能超过0.6cm。如果使用的是成年大鼠或小鼠，建议仅使用0.4-0.6cm长的尾尖。如果抽提鼠尾的DNA用于基因型鉴定(Genotyping)，使用0.2-0.3cm长的尾尖已经足够。
- 加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
  在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。并确保鼠尾浸没在裂解液内。裂解完全通常需6～8小时。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
- 清除RNA (可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，则加入4μL 100mg/mL RNase A，Vortex混匀。室温(15～25℃)放置2分钟。
  鼠尾中RNA含量很低，但在不做清除RNA的操作步骤(步骤2.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有少量的RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤2.d。
- 按照等体积混合适当体积的样品裂解液B和无水乙醇，Vortex混匀。
  每一个样品，需混合200μL样品裂解液B和200μL无水乙醇。如果有10个样品，则需混合2mL样品裂解液B和2mL无水乙醇，以此类推。配制好的样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液，室温放置，3个月内有效。必须Vortex充分混匀，否则会严重影响抽提效果。
- 最高速剧烈Vortex 15秒。加入400μL步骤d配制的样品裂解液B和无水乙醇等体积混合液，剧烈Vortex混匀。
  加入样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部用于和磁珠的结合，沉淀不会影响抽提效果。
- 转步骤1.f，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.f起的步骤。
从培养的动物细胞中抽提总DNA：
- 收集最多不超过500万的细胞，离心沉淀后重悬于200μL PBS溶液中。
  PBS需自备。如果使用冻存的细胞沉淀，先把细胞沉淀解冻，并轻轻弹散，然后再加入PBS。对于基因组DNA含量较高的细胞，例如HeLa细胞，应使用较少的细胞，例如100-200万HeLa细胞。
- 清除RNA (可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4μL 100mg/mL RNase A，Vortex混匀。室温(15～25℃)放置2分钟。
  在不做清除RNA的操作步骤(步骤3.b)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤3.c。
- 加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀。
- 加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
  加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。
- 加入200μL无水乙醇，Vortex混匀。
  加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部用于和磁珠的结合，沉淀不会影响抽提效果。
- 转步骤1.f，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.f起的步骤。
从动物血液中抽提总DNA：
本操作方法也适用于血沉棕黄层(Buffy coat)和骨髓(Bone marrow)的总DNA抽提。
- 取50～100μL红细胞无细胞核的血，或5～10μL红细胞有细胞核的血。
  人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的红细胞无细胞核，鸟、鱼、蛙等的红细胞有细胞核。红细胞有细胞核会导致相同体积的血液内DNA的含量非常高。
- 加入20μL蛋白酶K。
- 加入PBS至总体积为220μL，Vortex混匀。
- 加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
- 转步骤3.e，后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.e起的步骤。
从石蜡包埋的组织样品中抽提总DNA：
由于包埋的组织通常已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。乙醇或甲醛固定的石蜡包埋组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。需自备二甲苯。
- 取一块小于25mg的包埋块，加入1.2mL二甲苯，剧烈Vortex，以充分脱腊。
- 台式离心机最高速(12000～14000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
  - 去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
- 加入1.2mL无水乙醇，轻轻Vortex混匀，以去除残留的二甲苯。
- 台式离心机最高速(12000～14000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
  - 去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
- 重复步骤c和d一次，即再用乙醇洗涤样品一次。
- 弃上清后再最高速离心1分钟，用20μL枪小心吸除残留的液体。
- 室温放置数分钟至乙醇全部挥发。
- 加入180μL样品裂解液A。
- 转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
从甲醛固定的组织中抽提总DNA：
由于组织已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。甲醛或乙醇固定的组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。乙醇固定的组织可以参考甲醛固定的组织的抽提方法进行总DNA的抽提。
- 取不超过25mg的组织，用PBS洗涤两次，以充分去除固定液。
- 去除PBS，转步骤1.a，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.a起的步骤。
从革兰氏阴性菌中抽提总DNA：
- 离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
- 加入180μL样品裂解液A，充分重悬细菌。
- 转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
从革兰氏阳性菌中抽提总DNA：
需自备溶菌酶，并配制溶菌酶溶液：20mM Tris,pH8.0,2mM EDTA,1.2% Triton X-100,20mg/mL溶菌酶。溶菌酶在临使用前加入。
- 离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
- 用180μL溶菌酶溶液充分重悬细菌。
- 37℃孵育30分钟以裂解细菌。
- 加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀。
- 加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。
  - 不可把蛋白酶K直接加入到样品裂解液B中。
- 70℃孵育30分钟。
- 转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。
从酵母中抽提总DNA：
需自备用于裂解酵母的酶Lyticase，并配制酵母裂解液：1M山梨糖醇(Sorbitol)，100mM EDTA，14mM 2-巯基乙醇。
- 离心收集最多不超过50万个酵母，弃上清。
- 用600μL上述酵母裂解液重悬，加入200U Lyticase，30℃孵育30分钟。
  - 裂解的时间会随酵母的种类不同而有所不同，详细情况请参考Lyticase的说明书。
- 300×g离心10分钟收集沉淀，弃上清。
- 沉淀用180μL样品裂解液A重悬。
- 转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
从昆虫中抽提总DNA：
- 用液氮冷冻后研碎处理：
  ① 取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)，液氮冷冻后研碎，转移至1.5mL离心管中。
  ② 加入180μL样品裂解液A。
  ③ 转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
- 用匀浆器匀浆处理：
  ①取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)。
  ② 加入180μL PBS，用电动匀浆器或玻璃匀浆器匀浆。
  ③ 转步骤3.b，后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.b起的步骤。
从其它样品中抽提总DNA：
对于某些样品需使用特定的裂解液裂解，可以参考如下方法进行总DNA的抽提。
- 样品用200μL特定的裂解液裂解。裂解需确保呈溶液状态，如果有不溶物需通过离心沉淀去除。
- 加入20μL蛋白酶K。
- 加入200μL样品裂解液B，立即Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
  - 检查整个溶液的pH值，确保pH值小于7.0，否则DNA结合到磁珠的效率会很低。
- 转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。

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